Có rất nhiều phương pháp
được lựa chọn để tinh sạch RNA hoặc DNA đang được sử dụng, tuy nhiên việc tách chiết
DNA/RNA bằng Phenol/Chloroform vẫn được cho là một phương pháp hiệu quả. Tác
giả Jode Plank* của bài viết này sẽ cung cấp cho các bạn một vài khía cạnh thực
tế của việc sử dụng kỹ thuật này.
*Từng là tiến sĩ ngành Hóa sinh tại trường đại học Duke,
postdoc tại trường đại học California, Davis, hiện đang là quản lý minh họa
khoa học tại American Journal Experts.
Tách chiết DNA/RNA bằng
hỗn hợp Phenol/Chloroform đã được bàn đến trong nhiều bài báo, cùng với ý tưởng
làm thế nào để hỗn hợp dịch chiết hữu cơ có thể loại bỏ các protein ra khỏi
dịch nổi. Tóm lại, các protein bao gồm cả các thành phần kị nước và ưa nước,
thông qua sự gấp cuộn của protein ta sẽ thu được hỗn hợp chất cần tách đã tan
trong nước. Tuy nhiên, khi hỗn hợp được chuyển sang môi trường chứa cả hợp chất
phân cực và không phân cực không có chất
phân pha (ví dụ: phenol hoặc phenol/chloroform), chúng sẽ dễ dàng chuyển
sang pha khác. Các phân tử phân cực càng mạnh như carbonhydrate và axit nucleic
sẽ “thích” ở pha trên hơn (chỉ một vài trường hợp ngoại lệ là ở bên dưới) và
tồn tại ổn định ở pha đó. Vậy bản chất của vấn đề là gì?
Phenol, Phenol/Chloroform
và Chloroform
Phenol- nói chính xác đây
là chất đệm phenol bão hòa, có chứa 72% phenol và 28% nước, phenol bão hòa trong
đệm có tỉ trọng cao hơn nước chút ít. Vì phenol là một axit yếu, nên dung dịch
phenol mà chúng ta sử dụng phải được cân bằng với đệm nhằm đưa pH về giá trị
mong muốn, cụ thể là pH axit trong trường hợp tách chiết RNA, khi pH của dung
dịch có tính bazơ yếu thì chúng sẽ được sử dụng để tách chiết DNA. Ngoài một
lượng nước hòa tan vào phenol, thì cũng có một lượng phenol nhất định hòa tan
vào trong nước, ở trạng thái cân bằng pha nước sẽ có chứa khoảng 7% phenol. Lượng
phenol tan trong nước này giúp biến tính protein trong pha lỏng.
Phenol/Chloroform - đây là hỗn hợp đệm - phenol và chloroform bão
hòa, thường sử dụng với tỷ lệ 1:1 cho tinh sạch DNA và đôi khi là ở tỉ lệ khác
cho tinh sạch RNA. Isoamyl alcohol đôi khi được bổ sung vào với vai trò chống
tạo bọt, tuy nhiên nó thường được coi như một chất phụ gia trơ không bắt buộc. Dung
dịch Phenol/Chloroform thường được sử dụng thay thế cho dung dịch phenol bão
hòa vì 2 lí do: như tác giả đã đề cập ở trên, trọng lượng của phenol bão hòa
chỉ cao hơn trọng lượng của nước một chút, do đó, nếu pha lỏng của bạn có chứa
muối bão hòa hoặc các chất hòa tan khác, trọng lượng của pha này có thể tăng
lên, khi đó có thể thành phần các dịch trong ống sẽ bị đảo ngược, khi đó pha
lỏng của bạn sẽ ở dưới lớp phenol chứ không phải ở trên. Chloroform có tỉ trọng
nặng hơn nước nhiều, do đó việc bổ sung Chloroform vào pha hữu cơ sẽ làm tăng
toàn bộ trọng lượng của pha đó, giúp ngăn sự đảo pha.
Hơn nữa, chloroform (và
đôi khi có cả isoamyl alcohol) giúp giảm sự giao pha - phần không rõ ràng giữa
hai pha được tạo ra bởi các phân tử không thể xác định sẽ tồn tại ở pha nào. Chúng
có thể là các protein bị biến tính, DNA (phụ thuộc pH), và/hoặc protein liên
kết với DNA bị biến tính một phần (phần protein vẫn còn bám ở phân tử DNA), những
phần này là phần thực sự khó phân tách. Nếu bạn thao tác pipet không chuẩn khi
loại bỏ lớp dịch trên, bạn sẽ làm giảm độ tinh sạch của mẫu. Nếu quá rụt rè khi
hút, lượng mẫu tách được sẽ ít. Nếu may mắn thì mọi thứ bạn cần vẫn nằm nguyên
vẹn đúng trong pha mong đợi, tuy nhiên việc bổ sung thêm chloroform vào hỗn hợp
sẽ giúp sự phân lớp rõ ràng hơn.
Chloroform - thường được
sử dụng sau khi tách chiết phenol hoặc phenol/chloroform. So với nhiều dung
dịch hữu cơ, tách chiết protein bằng chloroform không thu được kết quả cao, tuy
nhiên nó lại rất hiệu quả khi cần loại bỏ phenol ra khỏi pha lỏng. Hãy nhớ rằng
pha lỏng bão hòa luôn chứa 7% phenol, mà phenol lại luôn phá hủy các protein. Do
đó, nếu bạn không loại bỏ được (hoặc ít nhất là làm giảm) lượng phenol trong
dung dịch axit nucleic không chứa protein, nó có thể quay trở lại ức chế hoàn
toàn hoặc ức chế một phần các enzyme mà bạn dùng để xử lý mẫu DNA hoặc RNA sau
này. Lượng chloroform vừa đủ sẽ loại bỏ được phenol khỏi dung dịch axit
nucleic. Khả năng tự hòa tan của chloroform trong nước thấp hơn 10 lần so với
phenol (~0.8%) và ít gây biến tính cho protein, chloroform cũng ít bị tủa cùng
với DNA bằng cồn hơn so với phenol mặc dù vẫn chưa có bằng chứng nào xác đáng
để chứng minh điều này.
Ete cũng có thể được sử
dụng để tách phenol ra khỏi pha lỏng. Tuy nhiên, do ete có đặc tính dễ gây nổ,
trong phòng thí nghiệm sinh học lại thường sử dụng đèn busen và những loại nhãn
dán có sẵn cồn nên để đảm bảo an toàn ete thường được thay thế bằng chloroform.
Phenol màu hồng không
phải là tốt
Chú ý: không sử dụng dung
dịch phenol hay phenol/chloroform nếu dung dịch đã chuyển sang màu hồng. Nguyên nhân là do xuất hiện quá trình oxi hóa đã
biến dung dịch này thành màu hồng/nâu và hợp chất này sẽ làm đứt gãy (nick) DNA
và làm phân hủy RNA. Hầu hết các chai phenol được bán dưới dạng thương phẩm đều
có chứa chất chống oxi hóa. Phenol trong môi trường pH axit có khả năng chống
lại được sự oxi hóa. Tuy nhiên việc chuyển phenol bão hòa (từ bình màu nâu)
sang một chai sạch hoặc một ống sạch để kiểm tra trước khi tách chiết luôn là
điều nên làm.
Rất nhiều
giá trị pH
Đôi khi, có vài người
không thu được DNA sau khi tách chiết bằng phenol. Nếu chuyện này xảy ra với
bạn hoặc ai đó trong phòng thí nghiệm của bạn, câu hỏi đầu tiên bạn cần nghĩ
tới đó là: “Bạn đã sử dụng loại phenol nào?”. Các phòng thí nghiệm thường tách
đồng thời cả DNA và RNA với cả 2 dung dịch phenol dạng axit hoặc kiềm, cũng có
người dùng luôn một chai mới mà không chú ý đến pH. Việc tách chiết các mẫu
chứa DNA với phenol axit sẽ làm DNA bị phân hủy. Khi bị phân hủy các mảnh DNA
sẽ đi vào pha hữu cơ. Đây là đặc tính hữu ích thường được sử dụng trong các quy
trình tinh sạch RNA. Đó cũng là một trong những lý do mà đệm phenol bão hòa
axit được sử dụng rộng rãi.
Ngày nay, một số phòng
thí nghiệm thất bại trong việc tách chiết DNA bằng phenol (không thu hồi được
DNA sau khi chiết), khi đó pH của phenol luôn được đưa ra xem xét đầu tiên. Nếu
vấn đề là do pH, bạn cũng không thể đặt máy đo pH vào trong dung dịch, không
thể dùng giấy pH do giá trị pH bạn đo được lúc đó chỉ là pH của dịch nổi. Phương
pháp sử dụng lúc này là pha loãng dung dịch phenol bằng methanol 45% theo tỷ lệ
1:9 (v:v) rồi đo pH bằng máy đo pH. Cách an toàn nhất để điều chỉnh pH là
chuyển phần dịch nổi của dịch phenol sang 1 ống mới chứa ~ 100mM đệm (đệm là
dung dịch có Tris pH 7.9 để DNA hoạt động), đảo trộn đều các pha sau đó đặt
chai ổn định cho tới khi các pha được phân tách lại, sau đó lại tiến hành đo pH
lại.
Đảo trộn
các pha
Việc tách chiết bằng
phenol/chloroform được cho là phương pháp hiệu quả nhất vì chỉ còn < 1%
protein còn dư trong pha lỏng sau lần tách chiết đầu tiên. Tất nhiên cần có
những bí quyết để đạt được được hiệu quả cao như vậy. Vùng bề mặt phân tách
giữa 2 pha, được hình thành rất nhanh chóng nhưng cũng rất mỏng. Khi tiến hành
vortex khoảng hai phút lớp màng này có thể hình thành nhanh hơn, tuy nhiên
không phải mẫu nào khi thực hiện cũng cho phép vortex. Nếu bạn định tinh sạch
các DNA có kích thước lớn như DNA hệ gen, bạn phải đảo trộn hỗn hợp mẫu nhẹ
nhàng hơn rất nhiều, bám sát quy trình hướng dẫn và cố gắng thận trọng hết sức
khi thực hiện bước này.
Ảnh hưởng
của biến tính và phân giải
Một số quy trình yêu cầu
biến tính và phân giải protein với Proteinase K trước khi tách. Cả hai bước này
giúp giảm được lượng hóa chất còn lại trong pha giữa (mặt phân pha), do đó cải
thiện được chất lượng DNA, RNA thu hồi. Dùng SDS trong khi biến tính protein
trước khi chiết DNA hoặc RNA cũng cho kết quả tương đối cao. Tuy nhiên mặt
khác, việc phân giải protein có thể làm giảm độ tinh khiết của axit nucleic. Trong
khi protein dạng toàn phần hầu hết sẽ được đảm bảo là phân tách tới pha hữu cơ thì những protein này khi được phân
cắt thành từng mảnh peptide nhỏ thì không phải tất cả các peptide nhỏ này đều
có cùng “đặc tính” hóa học với protein tổng số, mỗi loại sẽ có mức phân chia
riêng. Sẽ không có vấn đề gì lớn lắm nếu chỉ một lượng nhỏ peptide lẫn trong
axit nucleic, phụ thuộc vào các ứng dụng tiếp theo của bạn thì những chất tạp
nhiễm này cũng có thể sẽ ảnh hưởng đến chất lượng mẫu sau này. Tuy nhiên, tôi
đã phát hiện ra một cách để loại bỏ lớp phân pha này.
Phase lock
gel®
Đây là vấn đề thường gặp
ở 50% các phòng thí nghiệm nhưng chỉ dưới 10% số người làm thí nghiệm biết được
hiện tượng này là gì và nó hoạt động như thế nào? Tôi đã phát hiện ra hiện
tượng này trong khi tiến hành các nghiên cứu của mình, sau đó tôi đã ghi lại nó
trong báo cáo. Nói đơn giản, Phase Lock gel là 1 lớp nhớt giống như gel vasoline,
có tỷ trọng lớn hơn nước. Nếu bạn bổ sung dịch chiết của bạn lên nửa trên của ống
li tâm sau đó tiến hành li tâm, kết quả bạn sẽ quan sát thấy Phase Lock-gel nằm
giữa dịch nổi và pha hữu cơ. Phase Lock-gel ngăn cách 2 pha này hình thành lớp
phân pha khi tách chiết DNA/RNA.
Trong một nghiên cứu nhỏ nhằm chứng minh giả thiết
của mình, tác giả đã thay phần dye màu đỏ vào vị trí của pha chứa axit nucleic
và dye xanh thay vào vị trí của pha chứa protein
A) Phase Lock-gel được đưa vào đáy của ống eppendorf 1.5ml
B) Sau khi bổ sung phenol/chloroform và dịch nổi, cuối
cùng là bổ sung chất thay thế DNA.
C) Sau khi lắc khoảng 5 phút
D) Sau khi li tâm, gel phân tách pha hữu
cơ khỏi dịch nổi
E) Sau khi bổ sung phenol/chloroform và
lắc khoảng 5 phút
F) Sau li tâm lần 2, pha chứa chất thay thế DNA
bây giờ có thể được chiết ra cùng chloroform (trong cùng 1 ống nếu dung lượng
ống cho phép) để loại khỏi phenol
Như bạn có thể thấy, lớp
gel hình thành tồn tại bền vững giữa 2 pha, và nếu bạn muốn chiết mẫu lần 2,
bạn chỉ việc để nguyên mẫu trong ống sau đó có thể làm hai hay nhiều mẫu giống
nhau mà không làm ảnh hưởng đến độ tinh khiết của mẫu. Bạn không thể vortex hỗn
hợp 2 pha trong 1 ống có chứa thuốc thử này nhưng bạn có thể vortex hỗn hợp
trong 1 ống riêng sau đó bổ sung mẫu vào ống cùng với gel và li tâm. Có 2 loại
gel khác nhau, 1 loại dùng cho các mẫu thông thường (nhẹ hơn) và 1 loại dùng cho
các mẫu chứa muối và protein ở nồng độ cao (nặng hơn).
Dùng SDS để biến tính protein trong mẫu trước khi tách chiết sau đó dùng
Phase Lock-gel để phân tách các pha cho các mẫu DNA có độ tinh sạch cao, với chỉ
số 260/280 lên tới 1.8, tỷ lệ DNA, RNA thu hồi đạt hơn 98%.