Máy Real-time PCR: Những kinh nghiệm lựa chọn

Kỹ thuật Realtime PCR là gì?
Real time PCR (hay PCR định lượng) là một kĩ thuật về sinh học phân tử được sử dụng trong phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction-PCR), nhằm khuếch đại và cùng lúc xác định được số lượng của phân tử ADN mong muốn.
Trình tự thực hiện kỹ thuật Realtime PCR được thực hiên trong một máy luân nhiệt như sau:
  • Các mẫu ADN được gắn với mồi có chất phát huỳnh quang (mồi huỳnh quang).
  • Các mẫu ADN này sẽ được khuếch đại thông qua phản ứng PCR.
  • Máy Realtime PCR sẽ chiếu một chùm sáng kích thích có bước sóng nhất định vào các tube đựng mẫu ADN này.
  • Các mẫu ADN gắn mồi huỳnh quang sau khi bị kích thích, sẽ phát ra chùm sáng phát xạ.
  • Bộ thu dữ liệu (detector) bên trong máy luân nhiệt sẽ thu nhận và xác định bước sóng của ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các phân tử huỳnh quang bị kích hoạt trong mẫu.
Như vậy bản chất của kỹ thuật Realtime PCR bao gồm 2 kỹ thuậtKỹ thuật PCR và đo quang phổ.
Phản ứng PCR thường bao gồm các bước thay đổi nhiệt độ và các bước này được lặp lại 25-50 lần. Các chu trình này bao gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đầu tiên ở nhiệt độ vào khoảng 950C cho phép các axit nucleic ở dạng mạch đôi tách rời nhau thành các mạch đơn; giai đoạn thứ hai ở nhiệt độ từ 50-600C cho phép sự gắn kết của các mồi huỳnh quang với khuôn ADN; giai đoạn thứ ba ở nhiệt độ từ 68-720C, tạo điều kiện cho phản ứng trùng hợp được xúc tác bởi enzyme ADN polymerase.
Kinh nghiệm lựa chọn
Hiện nay, chúng ta có nhiều sự lựa chọn cho máy Realtime PCR. Dù thiết bị hãng nào thì chúng ta cần xem xét 3 yếu tố sau đây về mặt kỹ thuật của máy Realtime PCR. Đó là: Phần luân nhiệt, phần quang học và phần mềm điều khiển; mà chúng tôi vẫn ví như ông chủ (phần mềm điều khiển), quản lý nhà hàng (phần quang học) và bếp trưởng (phần luân nhiệt).
Phần luân nhiệt:
Bên cạnh đó, cần quan tâm đến loại tube sử dụng cho máy Realtime PCR. Phổ biến hiện nay là các tube 0,2ml và 0,1ml. Phản ứng Realtime PCR thường có thể tích 20 – 50 µl.
Ngoài công nghệ gia nhiệt bằng khối block, chúng ta cần biết thêm 1 công nghệ gia nhiệt quạt gió, có tốc độ gia nhiệt (15-20°C/giây) và độ đồng đều cao. Tuy nhiên khối block gia nhiệt vẫn phổ biến và truyền thống nhất.
Phần quang học:
Là phần quan trọng nhất của máy realtime PCR. Có 2 yếu tố cần xem xét là bộ thu dữ liệu (detector) và số lượng kênh màu để có thể phát hiện nhiều tác nhân cùng lúc.
Bộ thu dữ liệu có 3 loại phổ biến là Charge Couple Device (CCD Camera), Photomultipiler tube (PMT) và Photodiode.
Hãng thiết bị realtime PCR sử dụng công nghệ Photodiode hiện không phổ biến hoặc đã ngừng sản xuất. Chúng ta không cần nói sâu.
Detector công nghệ PMT thường đi kèm với công nghệ gia nhiệt quạt gió, các ống mẫu được đặt trên 1 đĩa rotor quay tròn liên tục như rotor của máy ly tâm (hình dưới)
Detector PMT chỉ có 1 mắt đọc duy nhất, quét qua từng đáy tube mẫu (khi tube mẫu đang quay). Tín hiệu huỳnh quang phát xạ sẽ chuyển đến detector PMT lần lượt của từng giếng. Mô tả thì có vẻ việc thu nhận dữ liệu sẽ chậm, tuy nhiên nhà sản xuất máy PCR công nghệ PMT đã có thể tăng công suất thu nhận dữ liệu lên tới 100 giếng trong 0,15 giây, thực sự là rất cao.
Ngoài ra một ưu điểm của công nghệ PMT là hệ thống quang học đứng yên, do vậy rất ổn định và chính xác, ít cần hiệu chuẩn.
Detector CCD ngược lại với detector PMT, đi kèm công nghệ gia nhiệt block, nó thu nhận dữ liệu tín hiệu huỳnh quang tất cả các giếng cùng một thời điểm.
Hệ thống quang học công nghệ CCD cần được hiệu chuẩn định kỳ để đảm bảo độ chính xác. Các nhà sản xuất thường cung cấp một bộ kit kèm theo máy để có thể hiệu chuẩn khoảng 5 lần. Chúng ta cần lưu ý điều này.
Số lượng kênh màu của máy realtime PCR sẽ giúp phát hiện một hay nhiều tác nhân cùng lúc. Tối thiểu một máy realtime PCR có 2 kênh màu, một số dòng máy có 6-7 kênh màu. Nên chọn các hệ thống có 4-5 kênh màu để có thể sử dụng các bộ kit Multiplex realtime trên thị trường và có mức chi phí đầu tư trung bình.
Phần mềm điều khiển
Một yêu cầu cơ bản là phần mềm phải thân thiện, dễ sử dụng và linh hoạt. Hầu hết các nhà sản xuất thiết bị realtime PCR lớn hiện nay đều làm được điều này như Thermo Scientific, Qiagen, Roche, Agilent, Biorad…
Bảng 1: Tổng kết kinh nghiệm lựa chọn mua máy Realtime PCR
TTKinh nghiệm lựa chọnLưu ý
1Phần luân nhiệt
Tốc độ gia nhiệtCàng cao càng tốt, càng giảm thời gian của chu trình realtime PCR. (Tuy nhiên nên lưu ý chọn tốc độ gia nhiệt phù hợp với thí nghiệm)
Độ đồng đều nhiệt độCàng cao càng tốt
Công nghệ gia nhiệt1. Block rắn (bằng vàng hoặc bạc)2. Gia nhiệt bằng quạt gió
Số lượng mẫu/ lần chạy máyCó thể lựa chọn loại từ 12 đến 384 giếng mẫu, tùy yêu cầu.
Ống đựng mẫuChọn loại 0,1ml hoặc 0,2ml
Tính hệ thốngCó thể lựa chọn 1 máy realtime PCR hoặc nhiều máy được điều khiển bằng 1 hệ thống máy tính.
2Phần quang học
Bộ thu dữ liệu (detector)Có 3 loại: Charge Couple Device (CCD Camera), Photomultipiler tube (PMT) và Photodiode
PhotodiodeÍt phổ biến
PMTGia nhiệt quạt gió, tốc độ gia nhiệt, giảm nhiệt và độ đồng đều cao.
CCDPhổ biến nhất, dễ sử dụng, linh hoạt, cần hiệu chuẩn định kỳ.
Số lượng kênh màuTừ 2-7 kênh màuCàng nhiều càng tốt
3Phần mềm điều khiểnChọn loại sử dụng đơn giản, thân thiện.