3340435836_d347c3ce3d_z-600x220
Nguồn ảnh: http://bitesizebio.s3.amazonaws.com/
Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng bộ kit thương mại gồm cột spin (spin column) chứa các hạt silic để tách chiết ADN hoặc ARN có ưu điểm nhanh chóng và đơn giản hơn so với phương pháp tách chiết thủ công. Tuy nhiên, phương pháp này cũng đòi hỏi những hiểu biết nhất định về bộ kit để đạt được hiệu quả tách chiết cao nhất và tránh những sai sót trong quá trình thực hiện. Vì vậy, trong bài này chúng tôi sẽ giải thích chi tiết các bước thực hiện cũng như một số lưu ý về các vấn đề gặp phải trong quá trình tách chiết acid nucleic bằng cột silic.
Bước 1: Quá trình ly giải (lysis)
Thành phần và nồng độ đệm ly giải thay đổi tùy theo mục đích tách chiết là ADN hoặc ARN, nhưng về cơ bản đều chứa các muối chaotropic (guanidine HCL, guanidine thiocyanate, urea và lithium perchlorate) ở nồng độ cao, làm mất tính bền vững của liên kết hydro, lực Van der Waals và các tương tác kỵ nước. Do đặc tính này, các chất chaotropic có một số tác dụng sau: 1) ly giải màng tế bào, 2) biến tính protein, ADN và các đại phân tử khác, 3) bất hoạt nuclease, 4) thúc đẩy quá trình gắn acid nucleic vào silic. Ngoài ra, một số chất tẩy rửa (detergent) và enzyme (thường dùng là proteinkinase hoặc lysozyme) cũng được sử dụng nhằm tăng hiệu quả hòa tan protein và quá trình ly giải.
Cần lưu ý trong quy trình tách chiết ADN plasmid, các chất chaotropic không được thêm vào dung dịch ly giải với mục đích tách plasmid khỏi ADN hệ gen trước, tránh trường hợp cả plasmide và ADN hệ gen đều được giải phóng cùng một lúc vì rất khó để phân tách ADN mạch vòng nhỏ với ADN hệ gen có trọng lượng phân tử cao.
Bước 2: Gắn ADN hoặc ARN vào cột sắc ký
Ngoài các muối chaotropic, cồn cũng được sử dụng để tăng khả năng gắn của acid nucleic vào silic, thường dùng là ethanol hoặc đôi khi là isopropanol. Việc tối ưu hóa lượng ethanol để tăng hiệu suất tách chiết acid nucleic cũng là vấn đề cần quan tâm. Quá nhiều ethanol sẽ làm ADN bị đứt gãy thành nhiều đoạn nhỏ ảnh hưởng đến khả năng đọc UV ở bước sóng 260nm, ngược lại quá ít ethanol sẽ gây khó khăn cho bước rửa muối trên màng.
Để kiểm tra hiệu quả gắn ADN lên cột, có thể lấy phần dịch chảy qua màng và kiểm tra sự có mặt của ADN quan tâm. Nếu bạn sử dụng chất tẩy rửa có chứa SDS trong quá trình ly giải, hãy thử sử dụng NaCl như một chất kết tủa để tránh việc nhiễm ADN hoặc ARN với chất tẩy rửa.
2000px-Qiagen_Mini_Spin_Column.svg
Nguồn ảnh: https://upload.wikimedia.org
Bước 3: Rửa ADN (hoặc ARN)
Đây là bước cần thiết để loại bỏ các thành phần còn sót lại trên màng như protein, polysaccharide hay thậm chí là chất màu nhằm đạt hiệu suất tách chiết và tinh sạch ADN hoặc ARN cao. Muối còn sót lại làm giảm quá trình rửa giải acid nucleic đưa đến kết quả đọc UV ở bước sóng A230 cao và tỷ lệ UV 260/230 thấp. Vì thế, một vài bộ kit thực hiện bước rửa bằng ethanol tới 2 lần.
Về cơ bản có 2 cách rửa mẫu. (1) Nếu mẫu chứa nhiều protein và các chất màu, cần sử dụng các chất chaotropic ở nồng độ thấp để loại bỏ các tạp chất trước và tieps theo dùng ethanol để loại bỏ chất chaotropic. (2) mẫu không chứa nhiều protein như quá trình tách chiết ADN plasmid hoặc tinh sạch sản phẩm PCR, thì có thể chỉ cần dùng ethanol để thực hiện quá trình rửa.
Bước 4: Loại ethanol bằng cách làm khô
Thực hiện ly tâm làm khô cột nhằm loại ethanol. Nếu cột lọc vẫn còn sót lại ethanol, nucleic acid không thể bị hydrate hóa đầy đủ dẫn tới hiệu suất tách chiết ADN thấp
Vấn đề gặp phải là không thể nhận biết ethanol còn sót lại trong mẫu tách chiết thông qua kết quả đo UV. Do vậy, cách nhận biết mẫu nhiễm ethanol là mẫu không chìm xuống gel agarose khi thực hiện bước tra mẫu kể cả khi có loading dye hoặc qua hiện tượng mẫu không đông lại khi ở trong điều kiện -20° C.
Bước 5: Rửa giải ADN hoặc ARN được gắn vào cột
Đối với ADN, do đặc tính ổn định ở môi trường pH kiềm nhẹ và tan nhanh trong đệm nên đệm Tris HCl 10mM ở pH nằm trong khoảng 8-9 thường được sử dụng làm đệm rửa giải. Ngược lại ARN lại ổn định tốt trong môi trường pH acid nhẹ và hòa tan hoàn toàn trong nước nên nước là dung dịch phù hợp để rửa giải (pH của nước thường nằm trong khoảng 4-5). Quá trình rửa giải đạt hiệu quả cao nếu ủ dung dịch rửa giải ở màng vài phút trước khi ly tâm.
Những vấn đề gặp phải khi tách chiết ADN hoặc ARN bằng kit và cách khắc phục
Hiệu suất tách chiết thấp: có thể do các nguyên nhân sau: (1) do giai đoạn ly giải, (2) điều kiện cho quá trình gắn không đúng, hãy đảm bảo rằng ethanol sử dụng có chất lượng tốt (100%), ethanol chất lượng thấp hoặc cũ có thể hút nước từ bên ngoài dẫn tới nồng độ không còn chính xác. (3) Nếu đệm rửa không chính xác cũng giảm hiệu quả gắn ADN hoặc ARN vào cột dẫn tới hiệu suất tách chiết thấp.
Độ tinh sạch thấp: nếu ADN tách chiết bị nhiễm protein (tỷ lệ 260/280 thấp) có thể do lượng mẫu sử dụng quá nhiều và protein không được loại bỏ hoàn toàn. Trường hợp ADN có tỉ lệ 260/230 thấp có thể do muối từ quá trình gắn hoặc đệm rửa vẫn còn sót lại. Hãy đảm bảo rằng ethanol chất lượng cao nhất được dùng để làm đệm rửa và nếu vấn đề vẫn tiếp tục xảy ra, cần có thêm một bước rửa nữa.
Thoái hóa: Điều này cần quan tâm khi tách ARN. Chủ yếu khi tách ARN, sự thoái hóa diễn ra do bảo quản mẫu không đúng cách hoặc quá trình lysis không tốt, cần phải đảm bảo việc rửa giải bằng nước không chứa RNAase. Đối với tách chiết ADN, sự thoái hóa không phải là một vấn đề lớn bởi vì đối với PCR, dù ADN bị đứt gãy thì nó vẫn hoạt động tốt. Nhưng nếu bạn thấy ADN bị đứt gãy quá nhiều, có thể là do bạn đã sử dụng bước ly giải quá mạnh.
Các lưu ý trong quá trình tinh sạch sản phẩm PCR: thực chất đây không phải là kỹ thuật tách chiết ADN, chỉ đơn giản thêm các muối gắn ở nồng độ cao (thông thường thể tích muối trên mỗi thể tích phản ứng PCR khoảng 3-5 ) và ly tâm cột. Do đó khi tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit thất bại, câu hỏi đầu tiên cần đặt ra là “bạn có kiểm tra kết quả phản ứng PCR trên gel hay không?” vì không thể kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR bằng cách đo UV để có kết quả chính xác vì có rất nhiều chất trong phản ứng PCR hấp thụ ở bước sóng UV 260 nm như: nucleotide, chất tẩy, muối và mồi. Theo kinh nghiệm, sự thất bại quá trình tinh sạch PCR bằng kit là do thất bại ở phản ứng PCR, nhưng nếu bạn biết có nhiều sản phẩm PCR, cách tốt nhất là bạn nên giữ lại các phân đoạn chảy qua sau khi gắn. Nếu có ADN ở đó tức là chúng không gắn vào cột, bạn có thể rửa lại một lần nữa, và có thể gọi người hỗ trợ kỹ thuật và yêu cầu thay thế bộ kit.
Dịch và tổng hợp từ Bitesizebio.com